嚢胞性線維症患者から分離された緑膿菌に対する生合成銀ナノ粒子の有効性

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8876 (2023) この記事を引用

306 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

緑膿菌（PA）は抗生物質耐性が高いため、効果的で手頃な価格の代替抗菌剤を開発することが重要です。銀ナノ粒子 (Ag NP) の多くの用途の 1 つは、一般的な抗生物質に耐性のある細菌に対する抗菌剤としての使用です。この研究の主な目的は、6 つのバイオフィルム形成臨床分離株および 1 つの参照株 (ATCC 27853) に対する生合成 Ag NP の抗菌および抗バイオフィルムの有効性を評価することでした。 Ag NP は、ペガナムハルマラの種子抽出物を還元剤として使用して生合成されました。 Ag NP は、紫外可視 (UV-Vis) 分光法および走査型透過電子顕微鏡 (STEM) によって特性評価されました。バイオフィルムの形成と根絶に対する Ag NP の効果は、マイクロタイタープレートアッセイによって検査され、最小阻害 (MIC) および最小殺菌 (MBC) 濃度が決定されました。さらに、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を実行して、PA バイオフィルムをコードする 7 つの遺伝子 (LasR、LasI、LssB、rhIR、rhII、pqsA、および pqsR) の発現に対する Ag NP の影響を調べました。生合成された Ag NP は、平均直径 11 nm の球形でした。各 PA 株の MIC は 15.6 μg/ml で、MBC は 31.25 μg/ml でした。阻害濃度以下の濃度（0.22 ～ 7.5 μg/ml）の Ag NP に曝露されたすべての PA 株は、増殖およびバイオフィルム形成に対して顕著な阻害効果を示しました。バイオマスおよびバイオフィルム代謝は、Ag NP 濃度に依存して減少しました。すべての菌株のクオラムセンシング遺伝子の発現は、Ag NP 濃度 7.5 μg/ml で大幅に減少しました。この結果は、Ag NP の広範な in vitro 抗菌および抗バイオフィルム性能と、PA 感染症の治療における Ag NP の可能性を実証しています。将来の研究では、Ag NP と抗生物質の間の可能性のある相乗効果を調べることが推奨されます。

緑膿菌（PA）は、免疫抑制、悪性腫瘍、火傷、外傷、嚢胞性線維症のある人に死亡を引き起こす可能性がある一般的な院内病原体です1。 PA は、人工インプラント、導尿カテーテル、気管内チューブ、コンタクトレンズなど、さまざまな非生物的表面にバイオフィルムを形成する可能性があります 2。細胞外ポリマー物質（EPS）は、細菌群集を取り囲むバイオフィルムのマトリックス様構造を形成します3。バイオフィルムは宿主の免疫システムや多くの抗菌剤に抵抗する可能性があるため、重大な懸念事項となっています3。抗菌ペプチドはバイオフィルムマトリックスから静電気的に反発されるかバイオフィルムマトリックスによって分解され、内部の細胞を食作用や宿主の免疫応答から守ります4,5。クオラムセンシング (QS) と呼ばれる細胞間通信システムは、バイオフィルム生成を含む PA のいくつかのプロセスを制御します6。

多くの抗菌薬の標的細胞はバイオフィルムマトリックス内に深く浸透しているため、その治療は非常に困難です7。抗生物質耐性は現在、世界的な健康上の大きな懸念事項となっており8、薬剤耐性微生物疾患に対する非抗生物質治療の必要性が大幅に増加しています。ナノ粒子は、サイズが小さく表面積対体積の比が高いため、バイオフィルムに対して効果的であるため、PA 感染症の治療に合成が容易な代替アプローチを提供します9。

一般的に製造される多くのナノ粒子の中で、Ag NP は、病原性の多剤耐性細菌分離株と戦う優れた能力を備えていることで際立っています 10。 Ag NP が、非耐性および耐性の病原性細菌の両方に対して抗菌活性および抗バイオフィルム活性を有することは広く知られています 10、11、12。 Ag NP は、細菌膜のペプチドグリカン構造を認識し、エキソ多糖マトリックスに結合することによって抗バイオフィルム活性を発揮します。その後、バイオフィルム構造は、ROS 生成とイオン放出によって生じる酸化ストレスと DNA 損傷によって、深刻な損傷を受けるか破壊されます 13、14、15。また、Ag NP は、その幅広いサイズ範囲、自己組織化能力、および高い抗菌活性により、医療およびその他の非医療用途で使用できる大きな可能性を秘めています 16。

生体媒介ナノテクノロジーは、ナノ粒子の製造にグリーンケミストリーの原理を組み込んでいます。植物抽出物は金属ナノ粒子の製造において広く研究されており、その単分散性を高めることができます。植物に含まれる生体分子（フラボン、フェノール類、タンパク質、多糖類、テルペノイド、アルカロイド、酵素、アミノ酸、アルコールなど）は効果的な還元剤であり、NP の構造を安定化および制御するキャッピング剤として機能します17、18、19、20。。バイオジェニック技術は、多くの化粧品や医薬品用途で使用されるナノ粒子を合成するクリーンで環境に優しいプロセスを提供します。したがって、ナノ粒子の環境に優しい生産のための生物起源技術の応用には広範な関心が寄せられています21、22。

一般にハルマルとして知られる無毛の多年生植物ペガナムハルマラは、半乾燥地域の砂質土壌に生育します。この低木は長さ0.3～0.8メートルで、50個以上の種子と白い花を持つ球形の種子カプセルを含んでいます。中東では、この植物は薬用に広く栽培されており、ヨルダンの辺境地域や砂漠地帯で見られ23、そこでは伝統的に種子を燃やすか煮ることによって防腐剤や消毒剤として使用されてきました24。この植物は、腰痛、喘息、疝痛、黄疸などのさまざまな人間の病気の治療に、また通経促進剤として使用されています 25,26。また、抗菌、抗ウイルス、抗真菌特性があるとも主張されています26,27。

現在の研究では、P ハルマラが銀 NP の生合成における還元剤として使用されました。 Ag NP の抗菌特性と抗バイオフィルム特性を、6 つの PA 株の臨床分離株で調べました。バイオフィルム形成中のさまざまな濃度の Ag NP への曝露の影響も評価されました。さらに、QS 調節に関与する遺伝子の発現および PA バイオフィルムの多糖類合成に対する Ag NP の影響が調査されました。

この研究では、American Type Culture Collection (ATCC) PA 27853 標準株と 6 つの臨床分離株 (PA1、PA2、PA3、PA4、PA5、および PA6) を使用しました。 PA ATCC は国際 PA パネルから取得され、その全ゲノム配列が入手可能です 28。この臨床株は、ヨルダン王子ハムザ病院の微生物検査室で嚢胞性線維症患者の喀痰サンプルから分離された。 PA 細菌の同定には、グラム染色、栄養寒天上での緑色色素の合成、マッコンキー寒天上での増殖、オキシダーゼ試験、運動性、選択培地セトリミド寒天上での増殖、および 42 °C での増殖能力を使用しました。検証には、VITEK2 コンピューター自動細菌同定システム (Bio Merière、リヨン、フランス) を使用しました。

Brain–Heart Infusion (BHI) ブロス技術を使用してサンプルを濃縮しました (OxoidTM)。濃縮後、シュードモナスセトリミド寒天 (PSA) (OxoidTM) 上でストリークプレートおよび混釈プレートアプローチを使用してサンプルを増殖させました。各株について、研究者らは単一コロニーから継代培養を開始し、すべてのコロニーを PSA プレート上で 37 °C で好気的に培養しました。 18 ～ 24 時間のインキュベーション後、新鮮な培養物を McFarland Scale で 0.5 の濃度 (1.5 × 108 CFU/mL) で調製しました。評価プロセス中に、いくつかの異なる希釈がテストされました。

P. ハルマラの全植物は、2022 年 7 月にザルカ県のアルハラバット地域から農業省の農場から収集されました。 P.ハルマラの種子の同定は、ヨルダン科学技術大学（JUST）農学部の植物標本館に保管されている検証済みサンプルとの比較によって確認され、農学部助教授（ムアヤド・バニ・ハニ博士）によって確認されました。引換券標本 (AM/2023/01/001) は、ヨルダンのジェラシュ大学の植物生産保護部門にある植物標本館に寄託されました。 P.ハルマラは、すべての制度的、国家的、国際的なガイドラインおよび法律に従って収穫されました。

種子を再蒸留水 (Sigma-Aldrich HPLC Plus Water) で洗浄し、室温で完全に乾燥させ、機械的に粉砕して粗粉末にした。この粉末 5 グラムを再蒸留水 50 ml と混合し、70 °C で 15 分間加熱した後、ワットマン濾紙で 2 回濾過しました。 0.22 mm シリンジ膜フィルターによる精密濾過を使用して、25 °C で pH 5.4 の透明な水性抽出物を生成しました。

3 mM AgNo3 溶液 50 ml を、ホイルで覆われた 100 ml 三角フラスコ中で 80 ℃ に温め、マグネチックスターラーを使用して 1100 rpm の連続速度で混合しました。水性P.ハルマラ種子抽出物を、マイクロピペットを使用して34μl/分の速度で4mlが添加されるまで滴下した。溶液の色のオレンジ色から暗褐色への変化は、Ag NP 合成の最初の兆候でした。次いで、溶液を６０００ｒｐｍで３０分間３回遠心分離して、未反応のＰハルマラを除去した。

紫外可視分光法 (UV-1900、島津製作所、日本) を使用して、AgNO3 の生物還元と P. ハルマラ水性抽出物からの生物起源の Ag NP の生成を視覚的に追跡しました。再蒸留水を対照基準として使用した。各分光光度分析は、光路長 1.00 cm の石英キュベット内で実行されました。 Ag NP の表面プラズモン共鳴 (SPR) は、Ag NP 形成のマーカーとして 800 ～ 300 nm の波長を使用して、紫外可視分光光度計を使用して測定されました。

走査透過型電子顕微鏡 (STEM) (Versa 3D、FEI、オランダ) は、薄い試料を通過する電子から得られる画像を生成します。これは、合成された銀ナノ粒子の形態とサイズ特性をテストするために使用されました。

酸化亜鉛 NP の X 線回折 (XRD) スペクトルを測定するために、X 線回折装置が使用されました。これには、波長０．１５４ｎｍのＣｕＫαを含む放射線源が装備されていた。標本容器の寸法は 2 cm × 0.5 mm でした。

Ag NP と P. ハルマラ種子抽出物の FT-IR 分析がハシミテ大学の化学科で行われ、P. ハルマラ抽出物の官能基と合成された Ag NP の関係を 3600 ～ 400 の波数範囲内で評価できるようになりました。 cm−1。

臨床検査基準研究所 (CLSI) の手順に従って、ディスク拡散を使用して、10 種類の抗シュードモナス抗生物質に対する PA 株の感受性を評価しました。生理食塩水中の細胞懸濁液を 0.5 マクファーランドに調整し、Muller Hinton Agar-MHA に接種して細菌の指数関数的増殖 (18 ～ 24 時間) (Sigma-Aldrich) を開始しました。プレートを抗生物質ディスクで覆い、35 ± 2 °C で 18 ～ 24 時間インキュベートしました。これらの抗生物質に対する細菌の感受性は、作成された阻害ゾーンの直径を測定し、CLSI 設定値に従って解釈することによって確認されました 29。

10 種類の異なる抗シュードモナス抗生物質が使用されました: アズトレオナム 30 μg (ATM)、シプロフロキサシン 5 μg (CIP)、ピペラシリン 100 μg (PRL)、アミカシン 30 μg (AK)、セフタジジム 30 μg (CAZ)、セフェピム 30 μg (FEP) 、ゲンタマイシン 10 μg (CN)、レボフロキサシン 5 μg (LEV)、イミペネム 10 μg (IPM) およびメロペネム 10 μg (CT)。すべての抗シュードモナスディスクは英国の Oxoid から購入しました。

抗菌剤の MIC は、12 時間のインキュベーション後に標的微生物の目に見える増殖を抑制するのに必要な最小濃度を指します。最小殺菌濃度 (MBC) は、抗菌剤への曝露後に微生物が生存状態を維持しないことを保証するために必要な最小濃度を指します (つまり、未処理培地でのその後の培養で増殖が観察されない)。

Ag NP の MIC は、マイクロタイターブロス希釈プロセスを使用して決定されました30。 Ag NP は、ATCC 参照株 PA 27853 および 6 つの臨床分離株に対して、3 回の別々の実験で使用されました。各試験では、Muller Hinton Broth (MHB) (Oxoid) 中の 5 × 105 CFU/ml の密度の細菌 100 μl を、異なる Ag NP 濃度を含む 96 ウェルアッセイプレート (Corning, NY) に添加しました。ＰＡＡＴＣＣ２７８５３を陽性対照として使用し、一方、陰性対照は、ＡｇＮＰを添加しないことを除いて同一条件下でインキュベートしたブロスを接種した。

試験に使用した Ag NP 濃度は 1 mg/ml ～ 3.9 μg/ml の範囲であり、2 倍連続希釈によって得られました。接種したマイクロプレートは、37 °C、150 rpm で 24 時間のインキュベーション期間を経ました。コントロールは 37 °C で 24 時間インキュベートされ、Ag NP を含まない接種されたブロスが含まれていました。 MIC エンドポイントは、ウェル内で識別可能な増殖が観察されなかった最小 Ag NP 濃度を指します。テトラゾリウムベースのマイクロタイター希釈を確認のために使用しました。

細胞の NADH は有色のホルマザン塩の生成を促進するため、テトラゾリウム塩は生細胞の代謝挙動を評価するための生物学的試験の試薬として頻繁に使用されます 31。したがって、テトラゾリウムベースの色素は、MIC を特定し、バイオフィルムを評価するために一般的に使用されます 32。この研究では、細菌の生存とバイオフィルムの発達の代謝マーカーとしてトリフェニルテトラゾリウムクロリド (TTC) が使用されました。最初の 24 時間のインキュベーション後、脱イオン水に溶解した 0.2 mg/ml TCC 40 μl をウェルに添加し、37 °C でさらに 4 ～ 6 時間インキュベーションを続けました。次に色の変化を評価し、対照の変化と比較しました。

色素の色を変化させない最低濃度を、標的細菌に対するMICとみなした。信頼性を得るために、陽性対照と陰性対照の両方を使用して実験をそれぞれ 3 回繰り返しました。

Ag NP MIC を確立した後、50 μl アリコートをすべてのウェルから播種しましたが、明らかな細菌の増殖は見られませんでした。それらをBHI寒天プレート上に置き、37℃で24時間インキュベートしました。その後、最低濃度の Ag NP による細菌の 99.9% の除去が MBC エンドポイントとされました (補足図 1)。

96 ウェル平底の滅菌未処理透明マイクロタイタープレート (BD Falcon)33 を使用して、さまざまな Ag NP 濃度下での細菌の増殖とバイオフィルムの発達を調べました。増殖試験を行うために、各 PA 培養物から標準懸濁液を作成しました。トリプトン大豆ブロス (TSB) 105 μl のアリコートを各ウェルに適用し、そこに細菌のアリコート 20 μl を加え、異なる濃度の Ag NP (0.225 ～ 7.5 μg/ml) 125 μl と混ぜ合わせました。これにより、マイクロタイタートレイの各ウェルの総量は 250 μl になりました。すべてのアッセイは 3 回実行されました。陽性および陰性対照も使用し、前者には PA および TSB が含まれ (Ag NP は含まれていない)、後者には TSB のみが含まれていました。

準備が完了した後、培養物を 37 °C で 24 時間好気的にインキュベートし、その間、暗所で保管し、振とうしました。インキュベーション後、600 nm での光学密度 (OD) を評価することによって、Ag NP のさまざまな濃度での細胞数を決定しました (Infinite® 200 PRO NanoQuant、TECAN)。各 Ag NP 濃度の最終的な細胞増殖値は、PA を接種した場合と行わない場合のウェル読み取り値の平均の差として計算されました。すべての細胞は、バイオフィルムに関連した浮遊細胞の増殖を示しました。

分光光度法を使用して、細菌細胞と EPS を含むバイオフィルムの総バイオマスを測定することでバイオフィルム生成を定量化しました 34,35。各試験条件に対して、2 つの異なるウェルを別々のマイクロタイタープレート上に並行して作成しました。次に、ウェルの 1 つをクリスタルバイオレット (CV) で染色し、もう 1 つを代謝 TTC 色素で染色しました。

プレートを振盪せずに24時間インキュベートした後(増殖実験と同様)、各ウェルを吸引し、滅菌生理食塩水(250μl)で3回洗浄した。ウェルを吸引した後、プレートを激しく振盪して未結合の細菌を除去した。

最初のプレート上の残りの微生物を 200 μl の 99% メタノールで固定しました。プレートを15分間放置し、その後空にして乾燥させた。次に、グラム染色安全溶液である 2% Hucker CV を各ウェルに 200 μl 加えて、各プレートを 5 分間染色しました。余分な染色物質を除去するために、ウェルを 200 μl の滅菌水で 3 回洗浄しました。洗浄段階でバイオフィルムを破壊しないように注意しました。次いで、プレートを再度放置して乾燥させた後、ウェル当たり160μlの33%(v/v)氷酢酸を使用して細胞結合色素を再可溶化した。

自動リーダー (ICN Flow Titertek Multiscan Plus) を使用して、ウェル内の OD 測定値を測定しました。測定値は 3 つの異なる時点で取得されました。最初は、サンプルをインキュベートする前 (OD 600 nm)。第二に、増殖を評価するためのインキュベーション後（OD 600 nm）。 3 番目はバイオフィルムテスト完了後 (OD 570 nm)。 570/600 の比率を使用して、細菌の増殖に対するバイオフィルム形成の測定を正規化しました。負の OD 値はゼロとして表示されました。各実験は 3 回実行され、標準偏差 (SD) からカットオフ値 (ODc) が決定されました。使用した ODc は、ネガティブコントロール + 3 SD の平均でした。次に、分離株を次の 4 つのバイオフィルム生産者カテゴリーに割り当てました。非生産者 (OD < ODc)。弱いプロデューサー (ODc < OD < 2 × ODc)。中程度の生産者 (2 × ODc < OD < 4 × ODc)。強力な生産性 (4 × ODc < OD)。

生菌増殖のマーカーとして TTC を使用して、2 番目のプレートで代謝活性を評価しました。 TTC は、代謝活性のある細胞によって、比色測定が容易なホルマザン誘導体に変換されます。増殖実験と同様に、プレートを激しく振とうして、37 °C で 24 時間インキュベートした後に付着しなかった細菌を除去しました。

インキュベーション後にすべてのウェルの培地を除去し、200μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用してバイオフィルムを洗浄した。 100μlのPBS溶液を添加した後、バイオフィルムを有するウェルからのバイオフィルム細胞を懸濁液中に激しくピペットで移した。次いで、懸濁したバイオフィルムを新しい96ウェル平底マイクロプレート上に移した。

５０μｌの０．１％ＴＴＣ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を添加することにより、０．０２％の最終濃度が得られた。サンプルを 37 °C で 4 ～ 5 時間インキュベートした後、VERSA max マイクロプレートリーダーで OD405 を測定しました。生菌が TTC36 を還元すると赤色ホルマザンが生成されるため、405 nm での比色吸光度は細菌の増殖の阻害を定量化する効果的な手段です。

EPS 生産に対する Ag NP の影響を評価するために、改良されたエタノール沈殿法 37 が使用されました。各菌株の EPS 抽出を 3 回繰り返して実行しました。 LBブロス中の各菌株の0.5マクファーランド細菌懸濁液を調製し、7.5〜0.225μg/mlの濃度範囲のAg NPを含むLBブロス100mlに加え、37℃で24時間インキュベートした。対照は、Ag NP を添加せずに調製されました。インキュベーション後、4℃、10,000 rpmで30分間遠心分離することにより細菌培養物からEPSを抽出しました。 EPS を沈殿させるために、遠心分離機から収集した各 3 容量の上清に 1 容量の 95% エタノールを加え、4 °C で 18 時間冷蔵下に置きました。次に、温度を 4 °C に維持しながら、混合物を再度 10,000 rpm で 20 分間遠心分離しました。沈殿したEPSを収集し、再蒸留水を使用して懸濁液に戻しました。０．４５μｍの酢酸セルロース膜を使用して濾過することにより、微量の細菌細胞を懸濁液から除去した。生菌が存在しないことを確認するために、最適な培養条件下でサンプルを寒天プレート上に置き、増殖をチェックしました。次いで、抽出されたＥＰＳを凍結乾燥し、秤量して、１００ｍｌ当たりのＥＰＳのｍｇの結果を得た。

CV 染色 34,35 と代謝感受性テトラゾリウム色素を組み合わせた技術を使用して、あらかじめ形成されたバイオフィルムに対する Ag NP の影響を評価しました。標準化された細菌懸濁液は、0.5 マクファーランド濃度の TSB を含む 2 つの 96 ウェルプレートで一晩培養することによって作成されました。バイオフィルムは、細菌懸濁液の20 μlアリコートをTSBの250 μlアリコート（Ag NPを含まない）に添加することによって生成されました。次にプレートを 37 °C で一晩インキュベートし、バイオフィルムが成長してプレートに付着できるようにしました。

個々のマイクロタイタープレート上に各条件ごとに 2 つの別個のウェルを作成し、1 つは CV による染色用、もう 1 つは代謝 TTC による染色用に作成しました。翌日、培地をプレートから取り外し、室温でペーパータオル上で15分間放置して乾燥させた。浮遊細胞と付着していない細胞を除去した後、マルチチャンネルピペットを使用して付着しているバイオフィルムを洗い流しました。このプロセスは、150 μl の滅菌培地を使用して 3 回実行されました。各ウェルでは、異なる濃度の Ag NP を含む新鮮な MHB 200 μl を添加する前に、過剰な洗浄培地を吸引しました。プレートを 37 °C で 24 時間インキュベートしました。翌日、浮遊生育を検査し、その後、浮遊細胞および使用済み培地を除去し、残留バイオマスを蒸留水で３回洗浄した。次いで、一方のプレートをCVで染色し、もう一方のプレートをTCCで染色した。次に、3 つの独立した生物学的複製の結果から平均 OD490 値が得られました 36。

QS 調節遺伝子の発現に対する高濃度 (7.5 μg/ml) および低濃度 (0.45 μg/ml) の Ag NP の影響を推定するために、qRT-PCR テストを実行しました。 PA を、6 ウェルプレート (Corning, NY) 内で 37 °C、50 ～ 60 rpm で Ag NP を含む MH 培地中でインキュベートしました。対照を同一の条件下で、ただしAg NPを使用せずにインキュベートしました。 24 ～ 48 時間曝露した後 (バイオフィルム成長の指数関数的段階)、バイオフィルムを注意深く回収し、10 mM NaCl で穏やかにリンスして、付着していない細胞を除去しました。バイオフィルム RNA は、RNeasy Mini Kit (Qiagen、ドイツ) を使用して抽出されました。

cDNA を合成するために、ランダムプライマー (RNaseOUT、dNTP、Superscript II 逆転写酵素 (Tsingke、北京、中国) を含む) を使用して 42 °C で逆転写 PCR 反応を行いました。定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) は、BIO-RAD Thermal を使用して実行されました。続いて、2 μl のテンプレート DNA を、各フォワードおよびリバースプライマーの 0.5 μl 溶液、10 μl の Luna Universal qPCR Master Mix、および 7 μl のヌクレアーゼフリー水に添加して、最終反応量を 20 μl にしました。。

この研究で使用したすべての PCR プライマーに対してグラジエント PCR 反応を実施しました。サイクル条件は、95 °C で 3 分間の予備変性を行った後、94 °C で各 30 秒間の変性サイクルを 34 サイクル実行し、50 ～ 63 °C の温度範囲で 30 秒間のアニーリングを実行しました。。続いて、72 °C で 60 秒間伸長しました。最後に、反応を 72 °C の温度で 5 分間延長しました。 QS 調節遺伝子の相対発現値をハウスキーピング遺伝子 rpoD および rpsL に対して正規化し、アガロースゲル電気泳動を使用して特異的な PCR 増幅を検証しました。処理された PA の遺伝子発現レベルは、未処理の PA の遺伝子発現レベルと比較して計算されました。これを行うために、2-ΔΔCt 技術が採用されました 38。この研究で使用したプライマー配列を補足表 1に示します。

HT29-MTX 細胞株は、メチルテトラゾリウム (MTT) アッセイを使用して Ag NP の細胞毒性を評価するために使用されました 39。 HT29-MTXは結腸の杯細胞に由来しますが、結腸の杯細胞に特徴的なMUC2ムチンではなく、呼吸器系細胞に見られる杯細胞に特徴的なムチンMUC5ACを分泌します。 HT29-MTX 細胞は、10% FCS (Sigma, UK)、50 U/ml ペニシリン、 50 mg/ml ストレプトマイシン (Sigma、英国)、50 mg/ml ゲンタマイシン (Lonza、米国)、および 50 μg/ml アンホテリシン B (Lonza、米国)。

次に、HT29 MTX 細胞を、50U/ml ペニシリン、50 mg/ml ストレプトマイシン、50 mg/ml ゲンタマイシン、および 50 μg/ml アンホテリシン B を含む無血清 DMEM 中で 24 時間静置しました。その後、Ag NP を 7.5 の濃度で添加しました。 –0.225 μg/ml。 Ag NP 処理細胞とコントロール細胞を 5% CO2、相対湿度 95% で 24 時間インキュベートしました。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳを使用して洗浄した。次いで、ウェルに２５ｍｌのＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、４時間インキュベートした。培地を除去し、１００ｍｌのＤＭＳＯと交換し、１５分間穏やかに撹拌した。細胞生存率に対する Ag NP の影響を評価するために、酵素結合免疫吸着アッセイプレートリーダーを使用して 570 nm の吸光度を測定し、Ag NP 処理細胞と対照細胞の生細胞パーセンテージを推定しました 38。

ハシミテ大学とプリンスハムザ病院の倫理サービス委員会は、この事例研究の倫理的承認を与えました（参照番号7/10/2019-2020）。すべての実験は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。喀痰サンプルからの PA 臨床分離株は、すべての CF 患者からインフォームドコンセントを得た後に採取されました。

実験結果を表すために、少なくとも 3 回の反復の平均 (M) および平均の標準誤差 (SEM) を使用しました。一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して、サンプルとコントロール間の差異を特定しました。さまざまな希釈でのマイクロタイタープレート実験 (ナノ粒子ありおよびなし) からの OD 値を、Tukey の検定を使用して比較しました。 0.05未満のP値を有意であるとみなした。データは、Graphpad Instat 6.0 ソフトウェアを使用して検査されました。

Ag NPの調製中、Ag NPの形成により、反応混合物の色がオレンジ色から暗褐色に変化します。これは、Ag NPの表面プラズモン共鳴（SPR）の励起によるAgNO3の減少を示しています（補足図2）。 UV-Vis スペクトル (図 1A に示す) では、461 nm 付近に幅広い吸収ピークが示されており、これは 450 ～ 500 nm で発生する Ag 表面プラズモン共鳴と一致しています。

(A – E) 合成された Ag NP の紫外可視スペクトル (A)。合成された Ag NP の STEM 画像、倍率 300 倍 (B) および 200 nm (C)。 Ag NP のサイズヒストグラム (D)、合成された Ag NP の XRD パターン (E)。

P. ハルマラ種子抽出物を使用して合成した Ag NP の STEM 画像を図 1 に示します。図 1B の暗視野画像は、それらが平均粒径約 11 nm の生合成 Ag NP であることを示しています。さらに、図1Cに表示されたAg NPの明視野画像は、合成された粒子の均一性、球形、および凝集の欠如を強調しています。 Ag NP のサイズヒストグラムを図 2D に示します。ヒストグラムは、この研究で作成した Ag NP の主な粒子サイズが約 10.9 ± 2.7 nm であることを示しています。

FT-IR スペクトル: (A) P. ハルマラ抽出物。 (B) 合成された Ag NP。

事前に下塗りした銀ナノ粒子サンプルの XRD パターンは、インドールの UGC-DAE 科学研究コンソーシアムで文書化されました。この目的のために、Bruker d8 Advance X 線回折計が使用されました。次のパラメータが適用されました: 放射線源、CuKα、λ = 1.5406 Å。 40 kV – 40 mA; スキャンモード、2θ/θ。

図 1 に示すディフラクトグラムと JCPDS 標準パワー回折カード、シルバーファイル No. 04-0783 を比較しました。 4 つのピークが 2θ 値、すなわち 38.2901°、44.5583°、64.8185°、および 77.4383° で認識され、これらは銀金属および hkl の関連する銀面値、すなわち (111)、(200)、(200) を反映するとみなされました。 ) と (311) です。図1D。

FT-IR は、Ag NP の安定性に影響を与える、Ag 原子と生理活性化学物質の間で起こる相互作用を特定するために使用されました (図 2)。わずかにシフトした同様の FT-IR スペクトルピークが、生合成された Ag NP および P. ハルマラ抽出物で見られます。図 2A、B では、異なる矢印の色は異なる官能基を表します。黄色は、P. ハルマラ抽出物スペクトルの 3533.98 cm-1 のピークを示します。これは、Ag NP 抽出物スペクトルの 3318.33 cm-1 に変化し、アルコール、フェノール、およびヒドロキシル基の OH 伸縮に割り当てられました。アミンまたはアミドのNH 基。赤は、P. ハルマラ抽出物スペクトルの 1608.36 cm-1 のピークを表し、Ag NP 抽出物スペクトルでは 1629.49 cm-1 に変化し、カルボン酸の C=O 基に割り当てられました。最後に、緑色の矢印は、725.87 cm-1 の P. ハルマラ抽出物スペクトルのピークを示し、これは Ag NP 抽出物スペクトルの 888.70 cm-1 に変化し、C=CH2 に割り当てられました。

抗生物質感受性は、ディスク拡散アプローチを使用して評価されました。 4 つの臨床分離株 (PA2、PA4、PA6、PA5) は、この試験で使用された抗生物質のうち 1 つ (ゲンタマイシン)、2 つ (イミペネムとレボフロキサシン)、4 つ (イミペネム、ゲンタマイシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン)、および 5 つ (メロペネム、それぞれゲンタマイシン、アミカシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン）。 3 つの臨床分離株 (PA3、PA5、PA6) がセフェピムに耐性があることが判明しました。ただし、分離株には多剤耐性 (MDR) がなかったことに注意することが重要です。補足表 2 は、ATCC および臨床株の抗生物質感受性試験の結果を示しており、研究されたすべての抗生物質に対して PA5 が最も高い耐性を示しました。

サンプルを好気条件下、濃度 3.9 ～ 1000 μg/ml の Ag NP とともに 37 °C で 24 時間インキュベートした後、3.9 ～ 7.8 μg/ml の Ag NP を含む試験管内に濁りが生じました。この濁度は、細菌がこれらの Ag NP 濃度で増殖していることを示しました。しかし、15.6 ～ 1000 μg/ml の濃度では濁りが見られず、細菌の増殖が抑制されたことがわかりました。 BHI 寒天プレートに、チューブからの 15.6 ～ 1000 μg/ml の懸濁液を 24 時間接種しました。 31.25 ～ 1000 μg/ml の濃度では細菌は観察されず、Ag NP が殺菌性であることが確認されました。したがって、これらの発見から、すべての PA 株の Ag NP の MIC および MBC がそれぞれ 15.6 および 31.25 μg/ml であったことは明らかです。

マイクロタイタープレートアッセイは、すべての株が強力なバイオフィルム生産者であることを示しました（詳細については補足表3を参照）。 0.225 ～ 7.5 μg/ml の範囲の濃度の Ag NP を使用して、さまざまな抗生物質に耐性のある PA 株 (参照株および 6 つの臨床株) に対する Ag NP の抗菌活性を評価しました。異なる菌株間の変動にもかかわらず、0.22～7.5 g/mlの範囲の用量でPA菌株をAg NPとインキュベートすると、増殖に悪影響が生じました（図3）。濃度 0.9 ～ 7.5 μg/ml では、Ag NP は 4 つの PA 株 (ATCC、PA1、PA2、PA6) で増殖を大幅に低下させることがわかりました (P < 0.05)。 PA3、PA4、および PA5 株は、1.8 μg/ml を超える濃度で顕著な影響を受けました (F (3.013, 11.08) = 61.93、P < 0.0001)。これを下回る濃度は、統計的に有意ではありませんでしたが、すべての菌株の増殖に悪影響を及ぼしました。ただし、0.225 μg/ml では、特定の PA 株 (ATCC、PA1、PA5、および PA6) の増殖が増加しました。

24 時間のインキュベーション後の PA 浮遊増殖に対する Ag NP の影響は、ATCC 株および 0.22 ～ 7.5 μg/g/g の Ag NP 濃度での 6 つの臨床的に分離された株 (PA1 ～ PA6) の 600 nm での吸光度 (y 軸) によって示されました。 ml (x 軸)。 ****< 0.0001、***0.0001、**< 0.001、*< 0.01。

3 つの株 (ATCC、PA2、PA6) のバイオフィルムの発達は、0.45 μg/ml 以上の濃度の Ag NP によって顕著な影響を受けました (F (1.931、11.39) = 17.12、P = 0.0009)。 PA1 および PA3 に実質的な影響を与えたのは、0.9 μg/ml 以上の濃度のみでした。 1.8 μg/ml 以上の濃度では、より耐性のある PA4 および PA5 株のバイオフィルム形成が大幅に減少しました (図 4)。

0.22 ～ 7.5 μg/ml の Ag NP 濃度で 24 時間インキュベートした後の ATCC 株および 6 つの臨床的に分離された株 (PA1 ～ PA6) のバイオフィルム発達に対する Ag NP の影響 (x 軸)。 ****< 0.0001、***0.0001、**< 0.001、*< 0.01。

バイオフィルムにおける PA 代謝の分析により、対照と比較して PA レベルが統計的に有意に低下していることが明らかになりました (F (2.757, 16.94) = 43.30、P < 0.0001) (図 5)。 TCC、ATCC、PA1、PA2、および PA6 のバイオフィルム細胞代謝は、0.9 μg/ml の Ag NP によって有意に阻害されました。 PA3 および PA4 に対する顕著な効果は、1.8 μg/ml 以上の濃度で観察されました。 PA5 株は、3.75 μg/ml を超える濃度でのみ顕著な影響を受けることが判明しました。それにもかかわらず、PA5 のバイオフィルム細胞の代謝活性は、すべての Ag NP 濃度で顕著な影響を受けました。

PA 浮遊細胞の代謝活性に対する Ag NP の影響。Ag NP 濃度 0.22 ～ 7.5 µg における ATCC 株および 6 つの臨床的に分離された株 (PA1 ～ PA6) の 4 時間の 600 nm (y 軸) での吸光度で示されています。 /ml (x軸)。 ****0.0001、***0.0001、**< 0.001、*< 0.01。

病院株と比較して、参照株は、検査したすべての Ag NP 濃度に対してより高い感受性を示しました。 ATCC 株に大きな影響を与えるために必要な Ag NP の濃度が低いことは、試験したすべての抗生物質に対して感受性があることが判明した抗生物質アッセイの結果を裏付けています。

EPS 産生に対する Ag NP の影響は、Ag NP を含まないか、または阻害濃度以下の Ag NP を含む PA 株を培養することによって調べられました。培養後に抽出された EPS の乾燥重量は、対照細胞よりも Ag NP 処理細胞の方が有意に低かった (F (6, 42) = 8.38、P ≤ 0.0001)。図 6 は、PA ATCC、PA1、PA3、および PA6 を 0.9 μg/ml 以上の Ag NP 濃度の存在下で増殖させた場合、PA ATCC、PA1、PA3、および PA6 から抽出された EPS の重量が対照の重量よりも有意に低かったことを示しています。 PA2、PA4、および PA5 では、1.8 μg/ml 以上の Ag NP 濃度で EPS 生成の減少が統計的に有意でした。

バイオフィルム EPS 産生に対する Ag NP の影響。Ag NP 濃度 0.22 ～ 7.5 μg/ml (x 軸) における ATCC 株および 6 つの臨床分離株 (PA1 ～ PA6) の EPS 乾燥重量 (mg/100 ml) によって示されます。）。 ****0.0001、***0.0001、**< 0.001、*< 0.01。

結果は、Ag NP が、1 日前に形成されたバイオフィルムの処理を評価する根絶アッセイにおいて CV 染色 PA バイオマスも有意に減少させたことを示しています (F (20, 66) = 9.148、P = 0.0001)。同時に、Ag NP は成熟したバイオフィルムの代謝活性を阻害しました。図 7 は、2 つの株 (ATCC、PA6) が 0.9 μg/ml を超える濃度で CV 染色バイオマスの統計的に有意な減少を示したことを示しています。 3 つの株 (PA1、PA2、PA3) も、1.8 μg/ml の Ag NP 濃度によって有意に阻害されました。 PA4 および PA5 の実質的な CV 染色は、3.75 μg/ml を超える濃度によって大幅に減少しました。

0.22～7.5μg/mlの濃度で24時間インキュベートした後の成熟バイオフィルムの除去に対するAg NPの影響（x軸）は、570 nmでのOD（y軸）で示されます。 (****0.0001、***0.0001、**< 0.001、*< 0.01)。

Ag NP とインキュベートした PA 株のあらかじめ形成されたバイオフィルムコミュニティの代謝は、有意に阻害されました (F (6, 7) = 15.32、P = 0.001)。 PA2 および PA3 株では、0.9 μg/ml の Ag NP 濃度が代謝活性を有意に阻害しましたが、ATCC、PA1、PA5、および PA6 の代謝活性を有意に阻害するには 1.8 μg/ml 以上の濃度が必要でした。 3.75 μg/ml 以上の濃度のみが PA4 代謝活性に有意な影響を及ぼしました (図 8)。

0.22 ～ 7.5 μg/ml の Ag NP 濃度で 24 時間インキュベートした後の TCC 染色を使用した、成熟バイオフィルム細胞の代謝活性に対する Ag NP の影響 (x 軸)。これは、570 nm (y 軸) での OD によって示されます (< 0.0001、***0.0001、**< 0.001、*< 0.01)。

計算された Ct 値を使用して、QS 制御遺伝子 lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsR、および pqsA の対応する発現を決定しました。まず、遺伝子発現を RopD 参照遺伝子の平均と比較して標準化しました。図 9 は、生合成 Ag NP (濃度 7.5 μg/ml および 0.45 μg/ml) に曝露した PA 株における QS 調節遺伝子の相対発現を、Ag NP なしで培養した対照サンプルと比較しています。図7が示すように、Ag NPはQS調節遺伝子の発現を減少させます。遺伝子発現を 100% と仮定したコントロールと比較して、7.5 μg/ml Ag NP で 24 時間培養した 2 株を除くすべての PA 株は、QS 調節遺伝子発現の大幅な減少を示しました。 2 つの例外 (PA3 の LasR および PA4 の LasI) は発現の減少を示しましたが、これは統計的に有意ではありませんでした。

Ag NPに曝露されていないコントロールの遺伝子発現と比較した、生合成されたAg NPに曝露されたPA株におけるQS調節遺伝子の発現に対するAg NPの影響。 Ag NP 濃度は 7.5 μg/ml および 0.45 μg/ml。 *< 0.01。

阻害の割合は株間および異なる遺伝子間で異なりました (表 1)。対照サンプルと比較して、7.5 μg/ml Ag NP では、Las 遺伝子システムの相対発現がすべての株で著しく減少しました。 LasR、LasB、および LasI の減少は、それぞれ 25.7 ～ 63.3%、13.2 ～ 51.4%、および 15.7 ～ 69.4% でした。 7.5 μg/ml の濃度では、rhIR と rhII の両方の遺伝子発現が、それぞれ 19.7 ～ 43.8% および 16 ～ 40.3% の範囲で統計的に有意な減少を示しました。さらに、高濃度では、PqsA および PqsR の発現が対照と比較して大幅に減少しました。

0.45 μg/ml の Ag NP 濃度では、特定の遺伝子の相対発現に対して統計的に有意な効果も見られました。 Las システム遺伝子が最も影響を受け、4 株 (ATCC、PA1、PA2、PA 6) では LasR 遺伝子の相対発現が統計的に減少しました。 LasI 遺伝子発現は ATCC および PA1 で有意に減少しましたが、LasB は PA1 でのみ有意な減少を示しました。 PA3 における rhII 遺伝子発現以外には、RhI および pqs システムに対する 0.45 μg/ml Ag NP 濃度の統計的に有意な影響はありませんでした。

MTT アッセイは、HT29-MTX 癌細胞株に対する Ag NP 細胞毒性の初期スクリーニングに使用されました。 HT29-MTX 細胞株は、使用したすべての濃度で Ag NP に対して高い耐性を示し、統計的に有意な細胞生存率の低下はありませんでした (F (6, 14) = 0.2871、P = 0.9334)。それにもかかわらず、細胞生存率は、Ag NP濃度7.5μg/mlの4.1%から0.225μg/mlの0.2%まで減少した(図10)。

24時間のインキュベーション後のヒトHT29-MTX細胞株の生存率に対するAg NPの異なる濃度の影響。相対的な細胞生存率を対照と比較しました (試験/対照 × 100)。実験は３回繰り返して実施した。

バイオフィルムを形成する微生物は多くの病気の原因となります。国立衛生研究所と疾病管理センターが実施したある研究では、バイオフィルム形成微生物が感染症の 65 ～ 80% を引き起こしていることが判明しました40。多くの研究は、NP が標的細菌に対する効果的なバイオフィルム阻害剤として機能することを示しています 41,42。さらに、以前の研究で、ZnO ナノ粒子がバイオフィルム形成 PA43 のバイオフィルムの発達を阻止する上で重要な役割を果たすことを発見しました。現在の研究は、生物学的利点と経済的利点の両方があると考えられているため、Ag NP 合成における P. ハルマラの使用に焦点を当てています。この発見は、生合成 Ag NP の重要な抗 QS、抗菌、および抗バイオフィルム特性を強調しています。

化学還元は、Ag NP を作成するために利用されるプロセスの 1 つです 44,45。削減アプローチは、他の代替方法よりも簡単で手頃な価格であると考えられています46。さらに、環境に優しい技術を使用して Ag NP を合成すること（つまり、植物と微生物の両方を含むグリーン合成アプローチ）を使用することが強く推奨されます 47。現在の研究では、植物の二次代謝産物からの還元剤を使用して NP を作成しました 48。 Ag NP はさまざまな植物を使用して生合成されており、さまざまな生物学的プロセスが評価されています。今回の研究では、伝統医学で広く応用されている多くの植物化学成分を含むハーブである P ハルマラが使用されました 49。

私たちの研究により、生合成中に硝酸銀がP haramla種子抽出物に曝露されるとAg NPが発達し始めることが明らかになりました。これは、色の変化と紫外可視分光法の使用によって確認されました。生合成された Ag NP は、SPR 特性の結果として 461 nm で強い吸収バンドを示しました。銀ナノ粒子の還元と安定性は、銀原子と生理活性化学物質の間の相互作用によって引き起こされる可能性があり 50、これらは FT-IR 分析を使用して調査されました。同様のピークは、Ag NP の合成に使用された P. ハルマラ抽出物の FT-IR スペクトルでも明らかでしたが、両方のスペクトルに小さなシフトもありました。種子抽出物ベースの Ag NP のスペクトルにより、1642 ～ 3351 cm-1 の範囲の吸収バンドが明らかになりました。これは、この生体分子が、水性種子抽出物中に置かれると、Ag NP 内の銀イオン (Ag+、Ag0) を還元して安定化する能力があることを示しています。

追加の TEM 検出により、これらの粒子の形状はほぼ球形であり、サイズが均一で、平均直径が 11 nm であることが明らかになりました。 Ag NP の抗菌特性は粒子サイズと負の相関があり、直径が大きくなるほど抗菌特性は弱くなります 51。 Choi et al.52 によると、15 nm 未満の Ag NP は細菌に侵入し、15 ～ 20 nm の Ag NP よりも実質的に強力な抗菌効果を発揮する可能性があります。 1 ～ 15 nm の粒子は細菌の表面に付着できます。

私たちは Ag NP を使用して、PA に対する殺菌効果をテストしました。我々の発見は、Ag NPが低濃度でPAに対して強力な抗菌効果を有し、MICとMBCがそれぞれ15.6～31.25μg/mlであることを実証した。 PA に対する Ag NP の MIC は、0.59 ～ 50 μg/ml であると報告されています 53、54、55、56、57、58、59、60。さまざまな研究で MIC 値の範囲が広いのは、ナノ粒子の物理化学的特性 (つまり、形状、サイズ、表面部分の存在) の違いが抗菌活性に大きな影響を与えるためです 51。当社の Ag NP の MIC は、既知の MIC の下限範囲と一致していますが、これはおそらく粒子サイズが比較的小さいためです。したがって、低濃度の Ag NP を使用して PA の成長を効率的に防ぐことができました。大腸菌 (E. coli) および黄色ブドウ球菌 (黄色ブドウ球菌) に対する Ag NP の阻害効果は、Azizi ら 60 によって研究され、P. ハルマラを使用して Ag NP も合成されました。生成された Ag NP はより大きかった (23 nm) にもかかわらず、中程度の阻害作用を示しました。これも、病原性細菌に対する Ag NP の有効性を示しています。しかし、PA に対する Ag NP の影響は、これらの著者によって調査されていません。

この研究では、さまざまな濃度の Ag NP の存在下での PA におけるバイオフィルム形成の阻害を調べるために、マイクロタイタープレートテストも実行されました。この結果は、実際にバイオフィルム形成の統計的に有意な阻害（図３、４）およびＥＰＳの減少（図６）が存在することを示した。我々の発見は、さまざまな細菌におけるバイオフィルム生成に対する銀NPの影響を調査し、濃度45μg/mlの銀NPがS.S.のバイオフィルム形成を阻害できることを発見したHaidariら61によって実施された以前の研究と一致している。黄色ブドウ球菌は 89%、大腸菌は 75% 減少しました。

PA ATCC PAO1 株に対する Ag NP (サイズ 7 ～ 70 nm) の有効性は Loo ら 62 によっても実証されており、EPS マトリックスの破壊により PA によるバイオフィルムの生成が 95% 減少することが示されました。 Ag NP は、細菌のバイオフィルムに重大な構造的損傷を引き起こす可能性があります。これは、細胞溶解14、細胞壁の損傷、膜の波形や膜の分極/透過性の破壊によって生じるバイオフィルムの形態の変化で見ることができます。特定の細菌株も、それらを取り囲む特定の EPS マトリックスを形成します 15。 Ag NP は細菌の膜と静電気的に相互作用し、これは膜を破り、NP が成熟したバイオフィルムに浸透するのに十分なほど強力です。しかし、Haneyらによって行われた研究63は我々の発見に反し、200μg/mlの用量の超常磁性酸化鉄ナノ粒子で細胞を処理すると、PAバイオフィルムのバイオマスが増加することが判明した。この効果は、細胞が鉄ナノ粒子を使用して元素鉄を提供し、細胞密度とバイオフィルムバイオマスの発達の増加が観察されるという事実によって説明されます。このプロセスは、Ag NP の場合には利用できません。

私たちの研究では、Ag NP は確立されたバイオフィルムのバイオマスを削減することができました。しかし、統計的に有意な減少を達成するには、初期のバイオフィルム形成に大きな影響を与えるのに必要な濃度よりも高い濃度が必要であり、バイオフィルムの主な機能は保護であるという見解を強化しています64,65。 Said et al.65 によると、バイオフィルムマトリックスがエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) と塩化ベンゼトニウム (BC) によって破壊されると、バイオフィルム細胞は Ag NP に対してはるかに感受性が高くなります (微量熱量測定で測定)。

我々の発見は、Ag NPが成熟バイオフィルムにおけるPAの代謝活性を低下させることを示し、これはLi et al.66およびKim et al.67によって提唱された作用機序と一致している。 Ag NP は細胞に入り、ペプチドグリカン、ペリプラズム、および外膜を通過する能力を持っています。ここで呼吸鎖脱水素酵素が破壊され、溶存酸素レベルが変化します66,67。さらに、Ag+ とシステインのチオール (-SH) 基の間で相互作用が起こり、-S-Ag が生成される可能性があります。次に、これは発生を阻害し、細菌細胞の酵素活性を抑制します66,68。

細菌の病原性とバイオフィルム形成能力は、天然の自己誘導物質（las および rhl22）によって活性化される転写調節因子を含む QS ネットワーク 69 によって制御されています。病原性形質の制御に加えて、QS は PA バイオフィルム形成能力も管理します。 Solano et al.70 および Brindhadevi et al.69 による研究では、変異した lasR および lasI を持つ PA がバイオフィルムを生成し、その効果は低く、抗菌薬によって簡単に除去できることが示されました。成長する群集の形状を調節するエキソ多糖類やその他の物質は、QS が活性化する遺伝子によってコードされています 40。

las、rhl、pqs システムなど、多くのシステムが PA システム全体におけるバイオフィルム形成の共制御に役割を果たしています。 LasI と RhlI は自己誘導物質の合成を制御しますが、lasR と rhlR は主に転写活性化因子のコーディングに関与しています 71。 Ag NP は las および rhl 経路を妨害し、シグナル伝達分子の生成を妨げ、抗 QS 影響による PA でのバイオフィルムの形成を妨げる可能性があります 64,72。本研究では、細菌細胞を Ag NP で処理すると、las、rhl、および pqs QS システム (lasR、lasI、lasB、rhlI、rhlA、pqsR、および pqsA) の多くの重要な遺伝子の発現が大幅に減少しました。対照との比較 (図 9 および表 1)。

Ag NP が PA の一次 QS システムを破壊する可能性があることが示唆されました。それにもかかわらず、バイオフィルムの発達は動的なプロセスであり、QS の生産は不可逆的な細菌の付着および接種後の細胞の増殖と拡大に続くことに注意することが重要です。その結果、バイオフィルム発達の最初の段階では、QS システムへの干渉によるバイオフィルムバイオマスに対する Ag NP の阻害影響は、確立されたバイオフィルムに影響を与えるのに必要な Ag NP 濃度よりも低い Ag NP 濃度でのバイオフィルム形成初期において明確でした。

現在、Ag NP は細菌の細胞壁の完全性と膜を破壊し、膜の透過性を高め、細胞死を促進することによって機能すると考えられています 73。さらに、Ag NP はスルフヒドリル基と結合することで呼吸連鎖反応を妨害し、脂質過酸化を引き起こし、DNA および関連タンパク質への酸化的損傷を促進し、その後細胞死が起こります 74,75。 Ag NP は硫黄およびリンの DNA グループにも付着し、最終的には DNA に損傷を与え、その転写と翻訳を妨害する可能性があります 76。さらに、Ag NP は細胞シグナル伝達を中断し、ホスホチロシンの脱リン酸化を通じて細胞死を開始します 77。 Ag NP が好気条件にさらされると、粒子の表面から Ag+ が放出される可能性があります。放出された Ag+ は細菌の細胞壁や膜と相互作用するため、顕著な抗菌効果をもたらします。これは、Ag NP の毒性の重要な理由の 1 つです 78。

Ag NP は抗菌剤として機能する大きな可能性を持っていますが、人体における安全性や、シュードモナス属を含む細菌における銀耐性の発現に関して懸念があります。 Ag NP の細胞毒性の可能性により、有望な化学療法剤としての確立が妨げられてきました。 Siddique ら 79 は、ニュートラルレッド取り込み試験を使用して、HeLa 細胞株に対する Ag NP の毒性潜在力をさまざまな濃度で調べました。彼らの結果では、これらのNPは120μg/mlの濃度までは無毒であり、統計的に有意な細胞毒性効果は、現在の研究で使用した濃度よりも高い240μg/mlの濃度で生じることが判明した。さらに、インビトロでのヒト細胞培養に対する Ag NP の影響を評価した研究では、Ag NP の毒性濃度は 10 ～ 100 μg/ml の範囲です 80、81、82。私たちの研究では、HT29-MTX細胞株に同様の濃度の生合成Ag NPをチャレンジした場合、統計的に有意な阻害は見出されず、Ag NPが少量使用した場合には安全である可能性があることが示唆されました。

細菌の水平遺伝子伝達による銀に対する細菌耐性の出現83は、家庭用抗菌剤だけでなく医療や工業における銀の使用の増加から生じた深刻な懸念である。いくつかの研究では、PA84 および他の細菌種 85,86 が、まだ知られていない還元プロセスを通じて、可溶性 Ag+ をコロイド状 Ag または NP Ag0 に還元できることが示されています 12。 Muller と Merrett86 は、Ag+ は細胞に浸透する前に細菌によって周囲環境から除去され、それによってタンパク質と銀の結合および細胞流出プロセスの必要性が低下すると提案しました。バイオフィルムに対する銀の破壊的および阻害的効果は、NAg およびイオン性 Ag+ の両方の形態の銀に適応するバイオフィルムを完全に妨げるわけではありません。それにもかかわらず、一般的に使用される抗生物質と比較して、銀は依然として有効な抗バイオフィルム剤である87,88。

Ag NP の殺菌効果を調べると、特定の PA 株は低濃度で予想外の増殖増加を示しました (図 3)。以前の研究では、殺菌レベル (3 ～ 8 μg/l) を下回る AgNO3 濃度が大腸菌の増殖を阻害するのではなく、刺激することが判明しました 89。同様の発見が Schacht et al.90 によって得られており、15 nm 未満で 20 ～ 60 μg/ml の濃度の Ag NP が一部の細菌の増殖を刺激することが判明しました。サイズが 2.8 ～ 10.5 nm で、ポリエチレングリコールでコーティングされた Ag NP が Xiu らによって示されました。 89 を使用すると、1.8 ～ 2.2 μg/ml の濃度で大腸菌 K12 の増殖が 6 ％から 13％増加します。著者らはまた、サイズが20～80 nmでポリビニルピロリドンでコーティングされたAg NPが、5.7～16.4 μg/mlの濃度で大腸菌の増殖を11～21％増加させることを発見した。

阻害剤への致死未満の曝露下での生物の増殖の増加または刺激は、ホルミシス反応として知られる二相性の用量反応です。微生物の特徴的な応答パターンは、低濃度の阻害剤で増殖が刺激され、高濃度で増殖が阻害されるというものです91。ホルミシス応答が見られた細菌に対する抗生物質の効果に関する研究では、それらは指数関数的増殖につながる可能性のある新しい生存メカニズムであると結論付けられています。低濃度の抗生物質の存在下。ホルミシス応答も NP に関連して研究されています 87,92 が、細菌細胞内でホルミシス応答がどのように達成されるかは、現時点ではほとんど理解されていません。現在の著者らは、「持続性」として知られる非遺伝的プロセスを参照して、これらの予期せぬ成長の促進を説明しようと試みている。

このメカニズムには、抗菌剤の影響が少ないため、他のより影響を受けやすい部分集団よりも長く生存する細胞の部分集団 (永続細胞) が含まれます 93. 低濃度の Ag NP (Ag+) を含む環境では、細菌細胞の防御メカニズムは十分な時間を保ちます。 Ag NP の毒性影響に適応するため。 DNA修復制御ネットワークの「SOS」応答94は、Ag NPの遺伝毒性効果によって引き起こされる細胞内の異常な一本鎖DNAの蓄積によって引き起こされます。

私たちの研究により、Ag NP が増殖を抑制し、バイオフィルムの形成を防止し、確立された PA バイオフィルムを除去できることが明らかになりました。これらの発見は、Ag NP が代替抗菌剤として、または抗生物質と併用して使用される有望な将来を強調しています。しかし、銀に対する耐性の発現には依然として懸念が残っています。したがって、Ag NP と抗生物質がさまざまな微生物、特に耐性のある病院株に対してどのように作用するかを理解するために、Ag NP と抗生物質の併用作用を調べることに研究を重点的に置くことが推奨されます。やがて、Ag NP は感染症と闘うための効果的な代替療法となる可能性があります。バイオフィルム形成のメカニズムについての理解が深まるにつれて、バイオフィルム感染の戦略的制御と治療が容易になるでしょう。 QS シグナル伝達カスケードは、病原性やバイオフィルム形成など、さまざまな細菌の活動に影響を与えます 95。 QS カスケードをブロックすることにより、細菌の病原性と毒性を低下させることができます。 PAバイオフィルムの発生を防ぐAg NPとQSIの分子機構を確認するには、さらなる研究が必要です。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

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サミール・アル・ハジ・マフムード

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マシュー・ウィルコックス & クリストファー・ウォード

ヨルダン、ジェラシュのジェラシュ大学農学部植物生産保護学科

ムエヤドバニハニ

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ムニーフ・アルダフィーリ、マシュー・ウィルコックス、ジェフリー・ピアソン

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ハム。研究計画、正式な分析、調査を担当し、実験を実施するためにDA、MA、LI、HABの監督を受けました。ハム。用意された図と文章 - 原案。 DA、MA、LI、HAB：いずれも研究補助であり、HA-MNA の監督下で実験を実施する責任を負い、PA 臨床株の分離と同定を担当する MK を担当します。 BA、SH、MA、SA: 銀ナノ粒子の生合成とナノ粒子の特性評価を担当します。 BA が図 1 を作成しました。MB: この研究で使用されたペガナムハルマラの正式な同定に着手しました。研究デザインを担当するAK、MW、JP、CWが原稿を共同執筆した。

ハーフェズ・アルモマニ氏への通信。

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Al-Momani、H.、Almasri、M.、Al Balawi、D. 他。嚢胞性線維症患者から分離された緑膿菌に対する生合成銀ナノ粒子の有効性。 Sci Rep 13、8876 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35919-6

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公開日: 2023 年 6 月 1 日

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